技术支持
您的位置:主页 > 技术支持 > 技术应用
高效液相色谱法检测鸡血浆中IgY含量

摘要:本文章建立了利用高效液相色谱(HPLC)检测鸡血浆中免疫球蛋白(IgY)含量的方法,检测用柱为蛋白G 柱。通过优化缓冲液流速和调节离子强度,获得最佳参数为:结合缓冲液:0.02M pH 7.0 PBS(流速0.2ml/min);洗脱缓冲液:0.1M pH 2.7 Gly-HCl(流速0.4ml/min)。

关键字:HPLC  蛋白G 鸡血浆  IgY检测 

IgY是蛋黄免疫球蛋白,一种普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类等动物体内的一种免疫球蛋白,是由具有免疫性的母鸡所生产的蛋黄中取得。IgY的结构与人体的抗体IgG类似,功能上等价于哺乳动物IgG。抗体IgY可以与体内的病菌抗原相结合,进而抑制病菌和肠壁细胞接触的机会,提供身体被动的免疫能力,来对抗抗原(细菌、病毒及外来蛋白质等)对身体的危害。其与哺乳动物IgG相比具有以下优势:它不与哺乳动物和细菌的 Fc 受体结合, 不激活哺乳动物体,也不与类风湿因子结合[4], 耐热、耐酸,巴氏灭菌温度下也不会失活并且在pH值小于3时仍能保持稳定活性[5]

上世纪80年代以来,IgY抗体被得到广泛的应用,目前,卵黄抗体(IgY)的制备主要集中于从鸡卵黄中提取[1~3],但提取量相对较低。鸡血浆中含有大量的IgY,通常占干重的15%以上,是获得IgY的重要来源之一[6]

目前,在IgY含量检测方面,有琼脂单、双扩散法、放射免疫法、免疫电泳法[7]、免疫比浊法、ELISAHPLC等,但都有各自的优缺点,本文主要涉及利用蛋白G柱的HPLC法检测鸡血浆中的IgY的含量。

1材料与方法

1.1主要材料和仪器

主要试剂:磷酸氢二钠(AR),国药集团;磷酸二氢钾(AR),国药集团;浓度为10mg/ml的鸡IgY标准品,美国Lifeholder;色谱柱为Pharmacia HI-Trap ProteinG柱,美国GE

试验材料:鸡血浆蛋白粉,上海杰隆生物制品股份有限公司。

主要仪器:HP 1100高效液相色谱仪,分析天平(精度0.1mg)。

1.2试验方案

由于目前国内尚无IgY标准检测方法,本研究通过对“饲料中免疫球蛋白IgG的测定方法[8]”进行优化,利用蛋白G柱建立适合IgY检测的方法。由于IgYG蛋白结合力相对IgG弱,故分别调整结合缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度以及两者的洗脱流速等,确定最适条件进行检测。

1.2.1缓冲液体系和标准曲线

结合缓冲液为0.02M pH 7.0 PBS,控制流速0.2ml/min;洗脱缓冲液:0.1M pH 2.7 Gly-HCl设定流速0.4ml/min 10mg/ml的标准IgY,用pH 7.0PBS缓冲液稀释成00.6251.252.55mg/ml浓度梯度,用于标准曲线制作。

1.2.2 IgY检测步骤

准确称取血浆蛋白粉0.2000g,溶解到10ml pH7.0PBS中,样品和标准品上样前均需经过0.22μm微孔滤膜过滤。检测样品之前分别用结合缓冲液和洗脱缓冲液平衡色谱柱,检测参照饲料中免疫球蛋白IgG的测定[8]

检测时上样后首先以结合缓冲液冲洗,用量为3~5倍的柱体积,然后更换洗脱缓冲液冲洗,用量为5倍的柱体积,最后用结合缓冲液平衡清洗柱子,用量为2~3倍的柱体积。回收率试验中对检测样品进行加标,检测回收情况。

2结果与讨论

HPLC检测时,对于检测峰的大小有一定的范围,峰面积太小检测的误差比较大重复性差,但是检测峰的面积也不宜过大,否则样品浓度过高,对标准曲线的适用度低,因此需要摸索一个合适的检测范围。IgY的检测峰往往要比哺乳动物IgG峰面积要小一半以上。通过对IgY结构和功能的比较[9],初步设定从离子强度和流动相的流速两方面着手,探索提高检测峰面积的方法。

2.1缓冲液离子强度和流速的优化

2.1.1 缓冲液离子强度的优化

GB/T 21033-2007中结合和洗脱缓冲液均为0.05M,运用到本试验中,峰面积只能达到1000。在此基础上,降低结合缓冲液PBS的离子强度到0.02M,并且增加洗脱缓冲液Gly-HCl的离子强度到0.1M,此时峰面积由原来的1000增加到1200,增加20%。如下表所示;

                      1 调整缓冲液离子强度后IgY峰面积变化

缓冲液离子强度

0.05M PBS 0.05M Gly-HCl

0.02M PBS 0.1M Gly-HCl

峰面积

1000

1200

注:上表中的比较基于结合缓冲液和洗脱缓冲液流速均为0.4ml/min

2.1.2 缓冲液流速优化

参照GB/T 21033-2007中缓冲液流速均为0.4ml/min,在优化离子强度的情况下检测峰面积为1200,仍然比较低,因此,为了更加有利于IgYG蛋白的结合,降低结合缓冲液的流速到0.2ml/min,洗脱缓冲液流速不变,检测峰面积有较大幅度提高,如表2所示峰面积由1200增加到2010,增幅为67.5%

                           2 调整缓冲液流速后IgY峰面积变化

缓冲液流速

结合流速0.4ml/min

洗脱流速0.4ml/min

结合流速0.2ml/min

洗脱流速0.4ml/min

峰面积

1200

2010

 

1不同条件下检测出的IgY峰面积比较

注:a.结合缓冲液:0.05M PBS,流速0.4ml/min;洗脱缓冲液:0.05M Gly-HCl,流速0.4ml/min

  b. 结合缓冲液:0.02 PBS,流速0.4ml/min;洗脱缓冲液:0.1 Gly-HCl,流速0.4ml/min

c. 结合缓冲液:0.02 PBS,流速0.2l/min;洗脱缓冲液:0.1 Gly-HCl,流速0.4ml/min

上图形象的表现了优化检测条件后,IgY峰面积逐渐增大的现象,说明IgY与蛋白G柱的结合能力相对提高,峰面积的增大为检测的准确性提供了保障。

2.2 运行方法优化

根据改进的方法,HPLC运行时间表设置如下图所示:

2 缓冲液冲洗过程中的时间以及流速设置

    运行方法的0~9分钟属于IgYG蛋白的结合过程,此过程中运行A泵,设置的流速为0.2ml/min,其后的10分钟为洗脱过程,运行B泵,流速为0.4ml/min,最后是用结合缓冲液平衡系统一段时间。

    禽血浆蛋白粉经此种方法检测,结果输出如图3所示,15分钟IgY开始洗脱出峰,持续1.5min,流量为0.6ml

                                      图3 检测图形

注:箭头所示为IgY检测峰形和出峰时间

2.3 鸡血浆蛋白粉中IgY的含量检测结果

2.3.1 制作标准曲线

检测不同浓度标准品,记录IgY的峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标做出标准曲线。

3 标准曲线中IgY浓度对应检测峰面积

IgY浓度(g/L

0

0.625

1.25

2.5

5

峰面积

95.7

1049.2

2129.2

4085.3

7239.5

 

4 标准曲线

由上图可以看出,在IgY浓度0~5mg/ml的范围内,IgY浓度(x)和峰面积(y)的对应关系:y=1430.7x+237.17R2=0.9958,可以在该范围内做检测。

2.3.2 样品检测和回收率计算

准确称取0.2000g鸡血浆蛋白粉,溶解到10ml0.02M pH7.0 PBS缓冲液中,震荡溶解静置半小时微滤上样。

                                            4 检测样品情况

样品信息

峰面积

IgY浓度(mg/ml

IgY含量(%

GZ030202

4001.8

2.631320333

13.16%

GZ030701

4428

2.929216467

14.65%

GZ032001

4189.1

2.762235269

13.81%

用标准品稀释成高中低三个浓度,对样品进行加标,检测计算出最后回收率分别为97.83%101.81%101.18%

3结论

利用蛋白G柱的高效液相色谱法检测鸡血浆IgY,根据G蛋白和IgY的结合特点,设定结合缓冲液PBS离子强度0.02M,流速为0.2ml/min,洗脱缓冲液Gly-HCl离子强度0.1M,流速0.4ml/minIgY终浓度0~5mg/ml之间和检测峰面积有较好的线性关系,回收率能达到97.83%~101.81%,并且该方法利用HPLC,能够做到高效、自动、简便快捷等,可以作为鸡血浆及其制品中IgY浓度测定的一个重要途径加以应用。 

 

参考文献:

 [1] Schade R,Staak C,Hendriksen C,Erhard M,Hugl H,Koch G,Larsson A,Pollmann W,Vanregenm ortel M,Rijke E,Spielmann H,Steinbusch H,Straughan D,The production of avian(egg yolk) antibodies:IgY-The report and recommendations of ECV AM Workshop 21 [J].Atla Alternatwes to Laboratory Animals,1996,24(6):925~934.

[2] Chang H M, Lu T C, Ch en C C, T u Y Y, H wang J Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides [ J ] . Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48 (4): 995~999.

[3] Herna Ndez Campos F J, Brito De La Fuente E ,Torrestiana Sanchez B Purification of egg yolk immunoglobulin( IgY) b y ultrafiltration: effect of pH , ionic strength, and membrane properties [ J ] . Journal of Agricultural Food Chemistry , 2010, 58 ( 1) : 187~193.

[4] Davalos Pantoja L, Ortega Vinuesa J L, Bastos Gonzalez D, Hidalgo Alvarez R .A comparative study between the adsorption of IgY and IgG on latex particles [ J] . Journal of Biomaterials Science : Polymer Edition, 2000, 11( 6) : 657~673.

[5]王炯,龚春梅,赵树栋,等.鸡卵抗体(IgY)理化特性的研究[J].中国生物制品学杂志,1997103:140~143.   

[6]童红飞,林东强,姚善泾.疏水性电荷诱导层析纯化免疫球蛋白IgY[J].化工学报,2011,626):1574~1580.

 [7] 马燕芬,王心刚,陈志伟,等. 前处理及液相色谱分离条件对牛初乳IgG含量影响的研究[J].乳业科学与技术,20075):224~229.

[8]中国国家标准化管理委员会.GB/T 21033-2007 饲料中免疫球蛋白IgG的测定 高效液相色谱法.北京:中国标准出版社,2007.

[9]陈阿琴,杨志刚,俞颂东.卵黄免疫球蛋白及其应用研究进展[J].中国兽药杂质,2005393:28~31.


返回顶部